IV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2012

Представлены результаты экспериментального панкреатита и описаны количественные и качественные изменения красной крови при деструктивных поражениях поджелудочной железы крыс.

Острый деструктивный панкреатит (ОДП) - полиэтиологическое заболевание. За последние 20 лет заболеваемость острым панкреатитом среди населения России увеличилась в 40 раз и занимает третье место среди заболеваний органов брюшной полости после острого аппендицита и острого холецистита. Летальность при этом заболевании колеблется от 6 до 26 % [1].

В основе острого панкреатита (ОП) лежит повреждение ацинозных клеток поджелудочной железы, гиперсекреция панкреатического сока и затруднение его оттока. Заболевание может возникать после травм живота, оперативных вмешательств на органах брюшной полости, острых нарушений кровообращения в поджелудочной железе (тромбоз сосудов, их сдавление или перевязка), интоксикаций, тяжелых аллергических реакций. Немаловажной при этом является роль алиментарного фактора, особенно при приеме избыточного количества пищи, стимулирующей панкреатическую секрецию (экстрактивных веществ, мяса, жиров, особенно животного происхождения, сладких алкогольных напитков типа ликера) в условиях нарушения оттока панкреатического сока, что характерно для больных желчнокаменной болезнью.

В ряде случаев развитию заболевания способствуют эндокринные нарушения, возникающие, например, при гиперпаратиреозе, беременности, длительном лечении препаратами кортикостероидных гормонов, врожденное или приобретенное нарушение жирового обмена (резко выраженная гиперлипемия), некоторые инфекционные и особенно вирусные болезни (например, эпидемический паротит, вирусный гепатит). К предрасполагающим факторам относят аллергию.

 В условиях повышенной функций поджелудочной железы и затрудненного оттока панкреатического сока активируются собственные ферменты железы (трипсин, химотрипсин, эластаза, фосфолипаза) с последующим ферментативным поражением ее ткани. Процесс начинается с выделения из поврежденных клеток железы ферментов, под действием которых трипсиноген переходит в трипсин, в свою очередь активирующий калликреин. Последний, действуя на киноген, образует высокоактивный пептид каллидин, быстро превращающийся в брадикинин. Под действием трипсина из клеток железы освобождаются гистамин и серотонин, в крови активируются фактор Хатемана и плазминоген. По лимфатическим и кровеносным путям панкреатические ферменты попадают в общее кровяное русло [1].

Первоначально в поджелудочной железе и других органах происходит сужение сосудов, затем их расширение, повышается проницаемость сосудистой стенки, замедляется кровоток, наблюдается выход жидкой части крови и форменных элементов из просвета сосудов в окружающие ткани, что приводит к отеку органа, кровоизлияниям в ткань железы и забрюшинную клетчатку. Расстройства местного кровообращения способствуют тромбообразованию. В условиях тромбоза сосудов в результате нарушения тканевого обмена и непосредственного действия на клетки ферментов формируются очаги некроза в паренхиме поджелудочной железы. Из разрушенных клеток освобождаются липазы, под действием которых возникает жировой некроз поджелудочной железы, сальника, забрюшинной клетчатки и др. Общие изменения в организме обусловлены вначале ферментной, а затем тканевой (из очагов некроза) интоксикацией. Воздействие на сосудистое русло вазоактивных веществ приводит к расстройству кровообращения на всех уровнях: тканевом, органном и системном, что является причиной дистрофических, некробиотических и некротических изменений. Экссудация в ткани и полости вызывает выраженные нарушения водно-электролитного, углеводного, белкового и жирового обмена.

Несмотря на большое количество различных оперативных методов лечения, смертность при инфицированном панкреонекрозе достигает 80-85%. Высокая летальность диктует необходимость разработки новых методов диагностики и лечения данного заболевания.

 Для точной и своевременной диагностики кровь используют как незаменимый источник информации о тех процессах, которые происходят в организме животных и человека [2]. Среди форменных элементов крови особое место отводится эритроцитам.

 Целью настоящего исследования явилось изучение динамики клеток красной крови животных при экспериментальном ОДП. Для достижения поставленной цели необходимо выявить количественные и качественные изменения эритроцитов в периферической крови крыс на разных стадиях патологического процесса при воздействии на организм травматических факторов.

Эритроциты (Э) - клетки конечного этапа эритропоэза, самая большая  популяция форменных элементов крови. Эритроциты в покое имеет форму двояковогнутого диска, который увеличивает его площадь и обеспечивает наибольшую поверхность газообмена. У белых крыс средний диаметр Э. 4,60±0,04 мкм, что близко к данному показателю у свиньи(4,13±0,04), кролика (4,47±0,06) и собаки (4,15±0,05) и значительно выше, чем у козы (2,63±0,02), овцы (3,41±0,03 и лошади (3,75±0,04). Средний объем Э крысы 51,2±1,43 мкм³. По  показателям концентрации сухих веществ в Э (42,28±0,47 г% / 100мл), содержании сухого вещества в Э, концентрации гемоглобина (9,67 ±0,220 г%) и плотности  (1,106±0,001·10³кг/м³) Э крысы наиболее близки к красным кровяным клеткам собаки и кролика[2].

На основе изучения количественных и качественных характеристик эритроцитов нами была поставлена задача: сравнить изменения, происходящие в организме крысы после операции (лапаротомии) и при моделировании острого деструктивного панкреатита (ОДП).

Материалы и методы исследования

Экспериментальный ОДП воспроизводили путем охлаждения селезеночного сегмента поджелудочной железы (ПЖ) хлорэтилом по А.С. Канаяну [3]. Опыты поставлены на 25 беспородных белых крысах-самцах массой 190-270 г(1-я группа).  Перед моделированием панкреонекроза грызуны голодали 24 часа, чтобы стандартизировать условия опыта, а также вызвать син­хронизацию секреторного цикла в ациноцитах ПЖ с накоплением в их цитоплазме гранул зимогена.

 Во вторую группу (n=15) вошли животные, которые были подвергнуты срединной лапаротомии и 1,5 минутной экспозиции селезеночного сегмента ПЖ. До и после операции крысы находились на стандартном лабораторном рационе при неограниченном количестве воды.

Контрольную (интактную) группу составили 5 крыс.

Животных первой группы выводили из эксперимента по 5 голов, из второй - по 3 крысы через 1 час после моделирования и на 1, 3, 7, 14 сутки. Забор крови проводили из левой яремной вены. Мазки крови окрашивали по Лейшману.

С целью оценки изменений периферической крови определяли количество форменных элементов крови, цветной показатель и лейкограмму. После идентификации и подсчета содержания клеток проводилась статистическая обработка по методу Р.Б. Стрелкова (1966). Различия считали достоверными при p < 0,05.

Из аутоптатов поджелудочной железы крыс, взятых в различные сроки исследования, изготавливались микроскопические препараты, окрашенные гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. Исследования поврежденных органов крыс производили с помощью световой микроскопии и электронной микроскопии. Для ультрамикроскопического исследования кусочки поджелудочной железы обрабатывали согласно общепринятым методикам и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-100C (Япония). Для морфометрической оценки функционального состояния ациноцитов использовали программное обеспечение анализа изображений ImageScope Color М (LEIСA, Gmbx).

         Результаты исследования и обсуждение

При гистологическом изучении микропрепаратов поджелудочной железы было установлено, что в ней развивался острый деструктивный панкреатит с образованием фокусов некроза, демаркационного воспаления, которые были наиболее выражены через час после операции.

Ацинарная часть представлена скоплением конусовидных клеток с базально расположенным овальным ядром; апикальная часть просветлена, оксифильно окрашена. В паренхиме обнаруживаются редко разбросанные панкреатические островки, состоящие из 8-12 клеток. Междольковая соединительная ткань слабо выражена. Встречаются мелкие, рассеянные очаги некроза экзокринной паренхимы, иногда захватывающие целые дольки. Заметны очаговые скопления полиморфноядерных лейкоцитов и мононуклеарных клеток (лимфоциты, макрофаги), которые «прилипают» к базальной мембране ацинарных клеток и проявляют цитотоксический и цитолитический эффект. Капилляры и мелкие венулы расширены, в просветах наблюдается небольшое количество эритроцитов (рис. 1).

С первых часов от начала ОДП развивается токсинемия за счет продуктов аутолиза ПЖ и токсинов микроорганизмов, преодолевающих эпителиальный барьер кишечника. Токсины нарушают проницаемость мембраны красных кровяных клеток, что приводит к укорочению продолжительности их жизни. В результате  снижается количество Э. как в первой, так и во второй группе (соответственно 4,53 и 4,5 ·10¹²/л), что вызвано потерей крови во время операции. Взаимосвязано с этим явлением и понижение общего уровня гемоглобина и цветного показателя по сравнению с контрольной группой (Табл.1,2,3).

Через сутки после моделирования панкреатита ядра ациноцитов в состоянии пикноза, гранулы зимогена не выражены. Островки Лангерганса не видны. Отмечена тенденция к увеличению числа лимфоцитов по ходу волокон соединительной ткани. Строма в участках некроза отечна, инфильтрирована лимфоцитами, имеются очаговые кровоизлияния (рис. 2). В первые сутки происходит уменьшение эритроцитарной массы у животных, перенесших лапаротомию, а в первой группе у животных с экспериментальным  панкреатитом за счет обезвоживания организма  наблюдается нормализация количества эритроцитов(5,0·10¹² /л) с высоким содержанием Hb (161 г/л). В обеих группах в мазках крови появляются «монетные столбики», что приводит к нарушению микроциркуляции и, как следствие, это ведет к образованию тромбов в венулах (Рис. 4,5).

На третьи сутки ОДП наблюдается тотальный некроз паренхимы с единичными сохраненными участками, в которых отмечаются некробиотические изменения эпителия ацинусов. Сосуды полнокровны. В соседних участках непораженной экзокринной паренхимы эпителий ацинусов в состоянии белковой дистрофии. Междольковый септы соединительной ткани с наличием фибробластов и моноцитов. В парапанкреальной клетчатке диффузноочаговое скопление лимфоцитов и палочкоядерных нейтрофилов с единичными эозинофилами.  Сосуды рыхлой соединительной ткани полнокровны. Отек стромы умеренно выражен. Островки Лангерганса незначительно отечны. В просветах кровеносных сосудов микроциркуляторного русла встречаются эритроциты видоизмененных патологических форм, т. е. наблюдаются явления пойкилоцитоза и анизоцитоза.

Таблица 1 Гемограмма интактных животных, п=5

Показатели	Эритроциты (10¹²/л)	Hb (г/л)	Цветной показатель	Лейкоциты (тыс./мкл)	СОЭ (мм/час)
М±m	5,0±0,52	150,0±3,4	1,0±0,02	5,5±1,4	1,0±0,08

 

Таблица 2  Гемограмма животных первой группы ( с экспериментальным панкреатитом), п=25

Показатель	Этап исследования
	1 час	1 сутки	3 сутки	7 сутки	14 сутки
	М ± m	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m
Эритроциты (10 ¹²/л)	4,53 ± 0,12*	5,0±0,8*	3,07 ± 0,3*	4,18  ± 0,21*	3,9 ± 0,33*
Hb  ( г/л)	152,3 ± 2,52*	161,0±5,4	111,0 ± 11,7*	129,8 ± 7,98*	120,0 ± 4,2*
Цветной пок-ль	0,96 ± 0,02*	0,9±0,09*	1,0±0,08	0,9 ± 0,03*	1,0±0,05
Лейкоциты (тыс./мкл)	9,73 ± 3,1*	5,4±0,7*	5,45 ± 0,72*	5,72 ± 0,46*	5,13 ± 0,84*
СОЭ (мм/час)	2,60 ± 0,84	5,0±0,81	1,5 ± 0,28	1,8 ± 0,21	1,66 ± 0,42

 

Таблица 3 Гемограмма животных  второй группы (лапаротомия), п=15

Показатель	Срок исследования
	1 час	1 сутки	3 сутки	7 сутки	14 сутки
	М ± m	M ± m	M ± m	M ± m	M ± m
Эритроциты (10 ¹²/л)	4,5 ± 0,63*	4,16 ± 0,21*	4,2 ± 0,43*	4,5 ± 0,85*	4,8 ± 0,78*
Гемогло-бин (г/л)	133,0 ±17,6*	134,3 ±11,3*	136,0±10,4*	139,0±12,0*	141,0±14,5
Цветной пок-ль	0,85± 0,02*	0,93 ± 0,42*	0,9 ± 0, 21*	0,9 ± 0,35*	1,0±0,57*
Лейкоциты (тыс./мкл)	5,8±2,1*	9,2±2,6*	8,9±2,5*	7,5±1,5*	6,5±2,7*
СОЭ (мм/час)	1,6±0,84*	4,0±0,84*	2,0±0,9*	1,0±0,09	1,0±0,09

* p≤0,05 по сравнению с интактными животными

На третьи сутки, несмотря на компенсаторные процессы, анемия нарастает и достигает максимального значения (3,07·10¹²/л) за весь период наблюдения у животных с экспериментальным ОДП (Табл.2). Это обусловлено повреждением и разрушением  Э под действием продуктов распада тканей поджелудочной железы.     Содержание Hb в Э становится наиболее низким, что приводит к гипоксии органов и  значительно тормозит процессы восстановления органов и тканей. У животных после ложной операции изменения в красных кровяных клетках менее выражены (количество Э- 4,2·10¹²/л, Hb-136 г/л), что объясняется менее выраженной степенью токсического воздействия на организм по сравнению с 1-ой (экспериментальной группой) (Табл.2,3).

При моделировании панкреатита на 7 сутки в экзокринной части поджелудочной железы наблюдаются обширные участки грануляционной ткани, вокруг них имеются диффузно расположенные лимфоидные инфильтраты. Выражено сосудистое полнокровие с периваскулярными кровоизлияниями. Неповрежденные участки паренхимы в виде фрагментов с набухшим эпителием ацинусов, в клетках которых наблюдается зернистая дистрофия. Наблюдается отек стромы.

 На седьмые сутки эксперимента постепенно происходит повышение количественных и качественных характеристик Э. как в 1-ой, так и во 2-ой группах (4,18 и 4,5·10¹²/л; 129,8 и 139 г/л соответственно). Это подтверждают наблюдения за животными, у которых улучшается общее состояние, повышается аппетит, идут восстановительно-регенеративные процессы на раневом участке.

К 14-м суткам в местах альтерации паренхимы поджелудочной железы начинала формироваться созревающая грануляционная ткань (рис. 3) . Динамика развития перифокальной воспалительной реакции сопровождается инкапсуляцией некротических масс ПЖ. Выявляемые вокруг ацинусов очаги некроза начинают замещаться фиброзной тканью, что приводит к образованию псевдокисты. Острая псевдокиста рассматривается как скопление панкреатической, богатой ферментами жидкости, которая возникает из-за разрушения панкреатического протока. Острое жидкостное скопление развивается в результате процессов воспалительной экссудации и имеет неправильную форму. Кистойды имеют неэпителиальную волокнистую стенку и могут быть связанными  с панкреатическим протоком. Активация фибробластов с образованием грубоволокнистой соединительнотканной капсулы, по всей вероятности, вызвана внутрижелезистой активацией трипсина, поскольку известно, что последний усиливает пролиферацию фибробластов и фибриллогенез, тем самым,  ускоряя процесс созревания грануляционной ткани. Наличие плотной капсулы, низкая активность палочкоядерных нейтрофилов и, соответственно, замедленная элиминация некротических масс придает процессу затяжной хронический характер. Гибель ацинарной ткани сопровождается развитием междолькового  и межацинарного фиброза и липоматоза. Очаговые деструктивные процессы в ПЖ с воспалительной инфильтрацией паренхимы, расширение выводных протоков являются морфологическим субстратом развивающегося хронического панкреатита (рис. 7,8).

 К 14-ти суткам у животных, перенесших лапаротомию, количество Э (4,8·10 ¹²/л) и содержание Hb (141 г/л), СОЭ (1 мм/час) находятся в диапазоне, приближающемся к физиологической норме (Табл.3). Однако, у животных с экспериментальным панкреатитом стабилизации красной крови не наблюдается, а наоборот, происходит снижение количественных и качественных показателей Э., возрастает СОЭ, что свидетельствует о развитии деструктивных процессов и подтверждается наличием панкреонекроза при вскрытии животных экспериментальной группы.

Выводы

1. Первичное снижение количественных и качественных показателей Э происходит в 1-е сутки, что объясняется кровопотерей во время операции, как в первой, так и во второй группе.
2. Наиболее резкое снижение количества Э и содержания Hb наблюдается на третьи сутки, что  связано с истощением компенсаторных процессов и усилением токсинемии на организм животных обеих групп.
3. В сосудах микроциркуляторного русла поджелудочной железы экспериментальных животных встречаются разнообразные патологические формы эритроцитов, т.е. наблюдаются явления анизацитоза и пойкилоцитоза.
4. Восстановительные процессы эритропоэза наиболее интенсивно идут у животных, перенесших лапаротомию и достигают низших границ физиологической нормы к 14-ти суткам.
5. В группе животных с ОДП на 14-е сутки усиливаются процессы разрушения тканей поджелудочной железы, что снижает качественные и количественные показатели Э, вызывая вторичные полиорганные поражения.

 

Библиографический список

1. Салиенко С.В., Маркелова Е.В., Сотниченко Б.А. / Иммунологические аспекты патогенеза острого деструктивного панкреатита и коррекция нарушений рекомбинантным IL-2 // Цитокины и воспаление. - 2006.- т. 5.- №4. - С. 46-50.
2. Воробьев А.И. Руководство по гематологии / А.И. Воробьев. - М., Медицина. 2002.- т.1, - 440 с.
3. Канаян А.С. Патологическая анатомия и патогенез панкреатита (экспериментальное исследование): Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Москва.1985 - 37 с.
4. Комарова Н.К., Свиридова Т.Г., Степовик Л.В., Хайруллина А.Б. Физико-химические свойства эритроцитов крови человека и животных в норме и при некоторых эндогенных и экзогенных воздействиях на организм / Учебно-методическое пособие.- Оренбург.-2003.- 19 с.

Код для цитирования: Скопировать