IV Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2012

Бактерии рода Azospirillum являются природными симбионтами высших растений, в том числе пшеницы, риса и других злаков, выращиваемых также в регионах с суровыми зимними условиями. В естественных условиях эти бактерии имеют две фазы жизненного цикла: фазу активной жизнедеятельности, совпадающую с вегетацией растения-хозяина, и фазу покоя. Известно, что небольшое количество покоящихся клеток азоспириллы переживает зимний период под оболочками зерновки растения-хозяина. В весенний период бактерии начинают активно размножаться, обильно колони­зирую корневую поверхность, межклетники корня и корневые волоски растения. Азоспириллы относятся к неспорообразующим бактериям, и особенности переживания (персистенции) зимних условий этими и другими рост-стимулирующими ризобактериями остаются малоизученными. Ряд представителей рода, в частности A. brasilense и A. lipoferum, входят в состав биопрепаратов для предпосевной обработки семян, что также делает важным изучение длительной персистенции азоспирилл в различных условиях.

Задачей данной работы было выявление факторов, блокирующих рост A. brasilense и способствующих переходу бактерии в состояние покоя.

В работе использовали два штамма, A. brasilense SR75 и Sp245, выделенных из стерильных корней или проростков пшеницы и являющихся природными симбионтами растений пшеницы. Бактерии пересевали на среды, неблагоприятные для роста и/или близкие по трофическому статусу к условиям зерновки, и наблюдали за ними в течение полугода. Во всех случаях стартовая плотность культур A. brasilense была равной 10⁷ кл./мл. Контрольный вариант (оптимальные условия роста) выращивали на синтетической малатной среде (СМС) следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 3.6; KH₂PO₄ - 2.4; MgSO₄·7H₂O - 0.2; CaCl₂·2H₂O - 0.02; NaCl - 0.1; Na₂MoO₄·2H₂O - 0.002; дрожжевой экстракт - 0.1; NH₄Cl - 0,5; FeSO₄·7H₂O - 0.02; малата Na - 5 г. Стрессированные варианты включали: персистенцию азоспириллы на СМС с добавлением гексилрезорцина - вещества, блокирующего деление клеток, а также персистенцию на физрастворе (0.85% NaCl), фосфатно-солевом буфере и на СМС, содержащей гексилрезорцин и СuSO₄. Состояние культур оценивали по оптической плотности (D₅₉₅); и кроме того, определяли жизнеспособность бактерий методом КОЕ (колониеобразующих единиц).

Анализ оптических данных показал, что присутствие в среде гексилрезорцина в концентрации 0.2 мМ не влияло на рост азоспириллы: значения D₅₉₅ были близки к контрольным. Когда концентрацию гексилрезорцина повышали до 0.3 мМ, бактериям удавалось преодолеть его ингибирующее действие, однако отдельные культуры (повторности) различались по динамике преодоления блокирующего действия этого адаптогена. Сочетание двух факторов, гексилрезорцин (0.2 мМ) и Сu (0.4 мМ), приводило к почти полной утрате жизнеспособности и существенному снижению оптической плотности. Варианты «персистенция на физрастворе» и «персистенция в фосфатно-солевом буфере» давали очень низкие значения D₅₉₅, но бактерии сохраняли высокий потенциал роста даже через полгода.

Оценка жизнеспособности бактерий, персистирующих на физрастворе и в фосфатно-солевом буфере (т.е. при практически полном отсутствии питательных веществ), показала очень высокую жизнеспособность азоспирилл, вплоть до 10⁵ КОЕ/мл  даже у полугодовых  культур. Важно отметить, что через три месяца при высеве на твердую питательную среду азоспириллы имели типичную для A. brasilense морфологию колоний, а через полгода хранения жидких культур в тесте КОЕ наблюдали выраженную фенотипическую диссоциацию: колонии значительно отличались друг от друга по размеру, форме и окраске. Отдельные фенотипические диссоцианты при пассировании через жидкие питательные среды восстанавливали характерную для данного штамма морфологию колоний.

Несмотря на то, что азоспириллы хорошо переживали жесткий трофический стресс, присутствие в оптимальной среде двух токсических веществ, гексилрезорцина и ионов меди, приводило к значительному падению жизнеспособности бактерий: в тесте КОЕ наблюдали отсутствие роста или 6-42 колоний на чашку. Присутствие данных токсикантов также индуцировало выраженную фенотипическую диссоциацию у A. brasilense,  но в этом случае даже у 8-дневных культур.

Таким образом, A. brasilense SR75 и Sp245 хорошо адаптируются к острому дефициту питательных веществ, в то время как добавление к оптимальной среде роста гексилрезорцина и меди приводит к почти полному подавлению жизнеспособности бактерий. Изученные стрессовые факторы индуцируют у азоспирилл фенотипическую диссоциацию, что расширяет их адаптационные возможности и облегчает выживание бактерий в неблагоприятных условиях.

Код для цитирования: Скопировать